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芯片耗材使用常见问题

2017-12-07  来源:master

问:血清中可能出现的沉淀物是什么?

 答:基于多年的实验研究,用于细胞培养的胎牛血清以及其它血清中可能会存在以下种类的沉淀物: (1)纤维蛋白,它是经常出现的较大的沉淀物,可以达到1-2mm,可以用肉眼观察到。因为血清都是在低温下进行收集和快速处理的,一些纤维蛋白原(可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体)在处理过程中仍然处于溶解状态,当经过最后的过滤分装后,就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。

(2)磷酸钙,它也是常见的一种沉淀物,通常会使血清出现浑浊,并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点,这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动,因此经常被误认为是微生物污染。

(3)胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是血清中出现沉淀物的常见原因。"识别仪常见问题另列表补充


问:血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响?

答:(1)细胞生长,我们的试验以及经验表明沉淀物不会影响细胞培养,我们的客户以及其它血清生产商也证明了这一点。

(2)过滤,如果血清中出现大量的沉淀物,血清将很难过滤。一般说来,因为在血清生产时最后已经经过100nm或者40nm的过滤处理,并且经过了严格的无菌检测,因此不推荐再过滤用于细胞培养的血清。在实验室中没有必要再过滤处理血清,在大规模的细胞培养中往往将血清直接加到培养基中一起过滤。 (3)污染,磷酸钙往往被误认为微生物污染而引起争端。研究者可能会在血清中观察到一些絮状的沉淀,因此就会比较警觉的去做无菌试验,将血清放在培养箱中培养几天,结果可能会观察到更多的絮状沉淀,因此就断定血清被污染了。并且当研究者将血清样品放在倒置显微镜下观察时往往可以看到一些可以运动的小黑点,因此就更加确认是血清被污染了。于是,研究者就会花费更多的时间和精力来和生产商确认,但最终确定血清没有被污染而只是沉淀。为了避免这些问题的发生,我们建议不要直接将血清放在培养箱中培养观察是否有菌,而是将血清加到琼脂板上进行培养以观察是否有细菌生长。另外,也可以进行革兰氏染色,在油镜下观察,以确认是否有污染。


问:如何避免血清中沉淀物的出现?

答:首先要注意正确的血清解冻步骤,而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动血清。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加,使用中应该尽量避免:

(1)热灭活血清;

(2)在37℃下培养血清;

(3)反复冻融;

(4)γ射线照射;

(5)长期储存在2-8℃;

(6)在室温下放置时间过长。


问:如何去除血清中的沉淀?

答:如想去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装到无菌离心管中,以400g离心,上清液即可直接加入到培养基内一起过滤。注意:不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物,因为这可能阻塞滤膜。


问:DMSO之等级和无菌过滤之方式为何?

答:冷冻保存使用之DMSO等级,必须为Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。


问:应如何避免细胞污染?

答:细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。


问:为何培养基保存于4°C冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性?

答:培养基保存于4°C冰箱中,培养基内之CO2会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH值。


问:购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?

答:研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少,大都是因为离心过程操作上的失误,造成细胞的物理性损伤,以及细胞流失。建, 议细胞解冻后不要立刻离心,应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。 问:购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因? 答:研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。 问:支原体污染会对细胞培养有何影响? 答:支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。


问:DMSO之等级和无菌过滤之方式为何?

答:冷冻保存使用之DMSO等级,必须为Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。


问:欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

答:欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg(约1000rpm),5-10分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。


问:悬浮性细胞应如何继代处理?

答:一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。


问:如何用台盼兰计数活细胞?

答:用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个/毫升,在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。