ToRCH检测试剂盒

 

国内外的现状、水平和发展趋势:

ToRCH4种人类致病微生物英文名称字头的组合:To 代表弓形体(Toxoplasma gondiiToxo)病毒;R 代表风疹病毒(Rubella Virus, RV)C 代表巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)H 代表单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,  HSV)。这4种病原微生物除容易感染人群引起多种疾病外,还可通过胎盘影响胎儿早期的正常发育并引起多种先天性疾病,有两个共同特征:

其一是孕妇由于内分泌的改变和免疫力下降易发生原发性感染,既往感染的孕妇体内潜伏的病原体也易被激活而出现复发性感染,妊娠期感染不仅危害母体,而且可引起宫内感染,导致流产、早产和死胎。胎儿受感染后,可能引起发育迟缓和先天畸形,造成新生儿智力障碍、各种瘫痪、失明、耳聋、失聪、弱智等严重后果, 对出生人口素质有着直接影响。

其二是一般成人感染后症状较轻或不出现明显症状,不易被察觉而忽视,无法自我感觉到是否受到感染,因此孕前及孕早期诊断对优生优育十分重要。             

ToRCH感染在围产医学中称之为ToRCH综合征,已经受到世界医学界尤其是妇产科和儿科医生的高度重视。ToRCH综合征是长期困扰我国优生优育工作的重要问题之一。孕妇在妊娠早期感染多造成流产和先天性畸形,妊娠晚期感染多导致早产、胎膜早破、新生儿感染等。孕妇抵抗力低下时一些潜在感染被激活,成为活动性感染。

目前临床和实验室多采用检测病原体特异性IgGIgM来诊断孕妇和胎儿的感染。通常认为IgM的产生是一种急性反应,感染后IgM13周内产生。母血中某病原体特异性IgM阳性可能发生胎儿宫内感染。IgM分子量大,不能通过胎盘,因此脐血中检出病原体特异性IgM即为先天性感染的诊断指标。其病原体IgM阳性的胎儿可能预后不良,可作为决定胎儿取舍的指标之一。

弓形体(Toxo是广泛寄生于人和多种动物有核细胞的原虫。弓形体病是一种世界性分布、具有广泛的自然疫原性人畜共患的疾病,其感染非常普遍,地区差别十分巨大,据血清学调查资料显示法国人群阳性率为80.0%左右,美国为25.O%~33.O%,我国感染率为4.O%~9.0%。先天性弓形体病是最重要的人类先天性病种之一,是我国优生、优育工作的重要研究课题。弓形体病是我国新生儿的一个重要致畸原因。到目前为止,在我国报道的弓形体畸形或出生缺陷病例至少有38[1],有无脑儿、脑积水、大头症、小头症、脑膜膨出、囊性或隐性脊柱裂,颅骨缺损、颅骨裂、小眼症、小眼裂、单眼、腭裂、龈裂、唇裂、悬雍垂缺如、鼻正中裂、耳壳无轮、漏斗胸、短手臂、六指()、肢体内翻和外翻、食管闭锁、肛门闭锁、食管气管瘘、直肠阴道瘘、脐疝、多囊肾、肾上腺缺如、内脏外翻、短阴茎、残角子宫畸形、双子宫、双阴道、阴阳人、联体畸形等。因此,易感人群特别是孕妇一旦在怀孕前夕、妊娠期内感染了弓形体,则对胎儿造成的危险是很大的。诊断主要靠检测血清抗体来实现。感染弓形体可产生免疫力,包括体液免疫和细胞免疫。首先出现IgM抗体,以后为IgG抗体,IgG可通过胎盘由母体传给胎儿,而IgM则否。因此,如婴儿查出IgM抗体则提示有先天性弓形体感染的可能。

巨细胞病毒(CMV)感染是妊娠期病毒感染中最常见、危害性最大的一种病毒,CMV感染通常以隐形感染为主或仅表现为轻微的感冒症状,因此,妊娠妇女应提高警惕,尽早进行CMV IgM的检测,以免CMV感染而危害胎儿。原发性感染(孕妇妊娠期内新感染CMV,以前未曾感染过CMV),导致胎儿先天性感染率最高,可达31%~40%。但孕期原发性感染率低,仅占约4%。CMV在孕妇及3月龄前胎儿、新生儿等人群中感染,特别是原发感染,往往引起严重的临床症状甚至致死。妊娠导致免疫功能抑制,促进了CMV原发感染的发生和潜在病毒的激活;而妊娠期间活动性CMV感染又使得免疫功能进一步受抑制,受感染孕妇免疫功能的抑制促进了胎儿宫内感染的发生并导致严重的后果,可发生流产、早产、死产、新生儿死亡[2]。若存活,CMV感染的新生儿绝大多数无明显症状和体征。仅有约10%新生儿出现低体重、黄疸、紫癜、肝脾肿大、智力障碍、视网膜脉络膜炎、脑内钙化、小头症等,多数患儿出生后数小时至数周内死亡,死亡率高达50%~80%,幸存者常有智力低下、听力丧失和迟发性中枢神经系统损害为主的远期后遗症;而无症状者中有5%~15%在生后2年始出现发育异常。一般急性感染指标(IgM)阳性的孕妇,若胎儿情况不佳,如心脏异常、胎儿腹水等应立即终止妊娠。

风疹病毒(RV)属于疱疹类病毒中的披膜病毒科风疹病毒属,是引起风疹的病原体,为RNA病毒。病毒经过呼吸道传播,潜伏期约2~3周,病毒增殖后进入血液引起病毒血症。风疹的临床表现类似麻疹,但较麻疹感染症状轻,合并症少。受风疹病毒感染的成年人,症状如一般的感冒,先有上感一般症状及耳后和枕下淋巴结肿大,随后面部出现潜红色斑丘疹并迅速遍及全身。多在1~3天内消退,预后良好。人群中感染率约为95%,常被人们忽视。孕妇在孕期6个月内感染风疹病毒,可通过胎盘侵犯胎儿(垂直传播),除引起流产、死产外,活产者大约29%表现为先天性风疹综合征CRS),即出生时体重低于2.5公斤,发育迟缓;出生后全身性器官受损,先天性心脏病,畸形,耳聋、失明等。CRS患儿最常见的是白内障等眼疾患,其次是耳聋,60%有心血管系统缺损。调查表明,感染风疹病毒与未感染风疹病毒的妊娠妇女相比,其死产和自然流产要高2~4倍。据统计,妊娠1个月内感染风疹病毒,婴儿先天性畸形的发生率为33%2个月内为25%3个月内为9%4个月内为4%以下[3]5个月内仍旧有先天性耳聋胎儿出生,妊娠6个月以外感染风疹病毒基本没有胎儿畸形的危险。孕妇急性感染阳性率为0.2~13%,不同地区、不同季节统计结果差别较大。根据我国育龄期妇女感染率不高的情况,应采取适当方法对少数易感的青年妇女进行保护,对婚前检查RV-IgG抗体阴性者,应逐步实行接种风疹疫苗的办法,且明确规定,接种疫苗前后2个月内禁止怀孕。

单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科,分为I型和II型,其感染途径主要通过分泌物和与易感染的人密切接触有关。I型疱疹病毒主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播,感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官,如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹,口和口周围发生的疱疹。II型病毒多感染腰以下部位,引起生殖器疱疹,它主要通过性生活传播,并可能与宫颈癌有关。I型和II型病毒均可引起脑膜炎和皮肤疱疹。 孕妇感染HSV可经胎盘传播或经生殖道上行性感染引起胎儿宫内感染,诱发流产[4]、早产(其自然流产或早产的机率是未感染孕妇的2~3倍)、死胎(死亡率90%以上)、畸形,发生的畸形与胚胎早期的弓形体、风疹病毒、巨细胞病毒感染造成的畸形相似,如小头、小眼球、脉络膜视网膜炎、脑钙化、血小板减少等,也可发生心脏及肢体异常、皮肤疱疹等。

目前医院诊断“ToRCH”感染的方法主要有下列三种:

1、形态学检查

病原体的培养分离,该方法准确性最高,但由于操作复杂,费时较长,需几周才能报告结果,且敏感性低,现在很少在临床诊断中应用;

2、免疫学诊断----测定血清抗体

1)荧光免疫实验(FIA)及放射免疫实验(RIA

FIA需要价格昂贵的荧光显微镜,染色标本不能长期保存,不宜作准确定量,而且对结果判定带有一定的主观性。RIA虽具有良好的敏感性、特异性和重复性,但由于同位素的价格昂贵、半衰期又短、需要复杂的仪器记录结果。另外,同位素在运输、贮存、应用和处理上都需要专门的安全防护设施,所以RIA的应用受到了很大的限制。

2)酶联免疫法ELISA

近年来报道较多的主要有血清诊断技术,这项技术起始于19世纪末,主要是检测血清内的抗体。这是一种快速简便的检查技术,并且在多种疾病中得到广泛的应用。1976Nussau首先将酶联免疫吸附试验(ELISA)应用于免疫学诊断。由于ELISA这种方法具有与同位素检测相似的灵敏度,并避免了同位素的放射性污染,因此国际上对ELISA评价很高,认为是近代血清学上的一个革命性成果。ELISA技术在病毒学中的应用,于1974年在英国获得成功,随后国内外一直没有间断这方面的研究。ELISA是目前各医院最为普遍开展的检测“ToRCH”感染的方法,其主要测定血清中抗“ToRCH”病原体的特异性抗体,如IgGIgM。这一方法的引入促进了ToRCH免疫学诊断的进展。一般来说,如果IgM阳性,表示孕妇近期可能有“ToRCH”感染(或称原发性感染),有引起胎儿畸形的可能;如果IgG阳性,往往表示过去有过“ToRCH”感染,对胎儿的影响不大,在我国育龄妇女中,大约有90%左右的人群风疹和巨细胞病毒IgG为阳性。

ELISA检测抗体时,存在的主要问题是抗原性较弱,致使ELISA这一技术难以取得实质性的进展,且无法进行单人份操作,只能批量检测。此外,国外原装试剂价格昂贵,国内试剂阴性本底高,特异性欠佳,假阳性或假阴性的情况普遍存在,质量不尽人意。

3)金标试剂盒

操作简单,适合基层单位使用,大都特异性不强,灵敏度也不高,而且对结果判定带有一定的主观性。

3、分子生物学诊断技术

20世纪90年代以来,随着分子生物学在医学领域取得的飞速发展,研究者也将分子生物学的原理引入了ToRCH试验研究范围。聚合酶链反应(PCR)是一种以核酸生物化学为基础的分子生物学诊断技术,是生物医学领域内最有价值的研究手段之一。自1989年引入ToRCH的诊断以来,立即成为细菌学诊断领域中备受关注的焦点。经过数年的努力积累了大量的资料和经验,使这一方法不断完善,其反应灵敏、特异、快速在大量数据报告中得到肯定。PCR的技术操作不复杂,但是要求很高的技术质量。因扩增气溶胶污染而导致的假阳性和因标本中抑制物质存在而导致的假阴性,以及缺乏规范化、标准化,是影响PCR结果可信性的关键。PCR的敏感性很高,可直接检测病原体,但不能判断人群的抗体水平,而且对实验室和试剂的要求比较高。在操作中循环的次数和浓度多影响检测的结果,增加非特异性问题产生假阳性。发生假阴性结果的原因也较多,主要有各种原因引起的酶活性降低,模板量太少以及引物作用受到影响等因素。

IgG 抗体和IgM 抗体的检测意义:机体具备一定的免疫力,当机体遭受病原体感染时,体内会产生相应的抗体(免疫球蛋白,Ig),来抵抗病原体,以保护机体功能的正常运转。一般规律是先产生 IgM 抗体IgM抗体出现较早(病期7~8天),很快上升到一定的滴度,随后迅速下降到较低的水平,在体内一般可维持数周至数月时间,偶尔也有一年以上的。然后产生 IgG 抗体 IgM 抗体滴度在达到高峰后很快开始逐渐下降至较低水平,下降后一般不易检出,而 IgG 抗体达到高峰后则基本稳定在一个较高的滴度且持续较长时间。检查出特异性 IgM抗体说明患者近期感染,潜伏的病毒被激活产生复发感染时亦可检出 IgM抗体。查出IgG抗体说明曾经感染过,而且有一定的免疫水平。当患者发生继发感染时,IgMIgG都能较快地上升到较高滴度,其中 IgG上升极其显著(一般可上升4倍以上的水平),因此临床上若测出高滴度的 IgG,则意味着再次感染。

在现有平台的基础上,拟设计开发ToRCHToxoRVCMVHSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ)IgM抗体检测试剂盒(斑点免疫渗滤法)(以下简称ToRCH IgM检测试剂盒)ToRCHToxoRVCMVHSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ)IgG抗体检测试剂盒(斑点免疫渗滤法)(以下简称ToRCH IgG检测试剂盒),用于育龄妇女孕前和孕期检查。

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